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2023-11-08 09:05:21 币圈百科

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基于Seurat UAMP和celltype的RNA Velocity速率分析的全套流程

参考资料：

参考生物技能树

Velocyto官网Tutorial

scvelo实战教程

Seurat-to-RNA-Velocity

分析步骤：

本教程是velocyto基于Seurat对象中UMAP和细胞类型进行RNA速率分析，推断细胞Cluster命运的状态（过渡与稳定）和分化方向性（轨迹）。

第一步：在linux系统中用velocyto将bam文件转换成loom文件；

第二步：按照scvelo需要的格式获取seurat中的UMAP坐标和Celltype信息；

第三步：在 python程序中整合loom文件和UMAP坐标和Celltype数据，并进行下游速率分析。

需要一些依赖

Successfully installed loompy-3.0.6 numpy-groupies-0.9.13 pandas-1.2.5 pytz-2021.1 velocyto-0.17.17

你如果要屏蔽repetetive elements，可以使用这一步骤

我们这个单细胞转录组使用cellranger流程的话，需要重复数据的gtf文件，rmsk。

进入UCSC官网，在Tools菜单中打开Table Brower，选择目的物种以及个性化的需求

理论上，这下一步命令，就可以完成bam转换成loom文件，但是因为 samtools问题，上面的流程可能是会失败。这个时候可以自行先运行 samtools sort 命令处理得到 cellsorted_possorted_genome_bam.bam 文件。

参考官网

需要确保我们添加umapCell ID和anndata对象中的Cell ID的顺序完全匹配，Cell ID是对象的观察层中的行名，因此我们可以使用以下方法更改

一步、我们把index提取成表达矩阵并更改列名；

二步、由于多个样品合并成adata时Cell ID后面多了“-0”（如下图）,为了完全匹配Cell ID，通过apply和split去除“-0”（保证adata和seurat中barcode名字相同）；

三步、umap坐标和celltype添加到anndata 对象。

我们现在可以运行scVelo命令，并根据Seurat UMAP坐标生成RNA速度图

这可能是最重要的部分，因为我们建议用户不要将生物学结论局限于预测的速度，而是通过阶段画像来检查个体基因动力学，以了解推断的方向是如何由特定基因支持的。

参考下图思考如何解释spliced vs. unspliced 时相特征[图1.6a]。基因活性是由转录调控调控的。对特定基因的转录的诱导表达，会导致前体unspliced mRNAs 的增加，而相反地，转录抑制或缺失会导致unspliced mRNAs 的减少。spliced mRNA由未剪接的unspliced的mRNA产生，具有相同的趋势，但存在时间滞后。时间是一个隐藏/潜在的变量。因此，动力学需要从实际测量的东西来推断: 在相位图中显示的剪接和未剪接的mrna。

用scv.pl.velocity(adata, gene_names检查某些特定基因的时相特征

黑线对应于估计的“稳态”比率，即处于恒定转录状态的spliced 和 unspliced mRNA丰度之比。一个特定基因的RNA速度是由残差决定的，即观察值偏离稳态线的程度。正速度表明一个基因被上调，这种现象发生在细胞中，在稳定状态下，该基因的unspliced mRNA的丰度高于预期。相反，负速度表明基因被下调。

例如，Cpe解释了上调的Ngn3(黄色)向Pre-endocrine(橙色)向β-cells(绿色)的方向，而Adk解释了下调的Ductal(深绿色)向Ngn3(黄色)向其余内分泌细胞的方向。

我们需要一个系统的方法来识别基因，这可能有助于解释最终的向量场和推断的谱系。为了做到这一点，我们可以测试哪些基因具有集群特有的差异速度表达，与其他种群相比显著地更高或更低。模块scv.tl.rank_velocity_genes运行一个差分速度t检验，并为每个集群输出一个基因排名。可以设置阈值(例如min_corr)来限制对候选基因的测试。

例如，基因Ptprs、Pclo、Pam、Abcc8、Gnas支持从Ngn3高EP(黄色)到Pre-endocrine(橙色)再到Beta(绿色)的方向性。

由RNA速度检测的细胞周期，在生物学上由细胞周期分数(阶段标志基因平均表达水平的标准化分数) 确定。

特别是hell和Top2a非常适合解释周期祖先中的向量场。Top2a在G2M阶段达到峰值前不久被赋予了一个高速。在这里，负的速度与紧随其后的下调完全匹配。

两个更有用的stats:-速度或分化率是由速度矢量的长度给出的。-矢量场的一致性(即，速度矢量如何与其邻近速度相关联)提供了一个可信度的度量。

这些提供了细胞在哪里以较慢/较快的速度分化

在集群水平上，我们发现分化在细胞周期退出(Ngn3 low EP)后显著加快，在Beta细胞生产期间保持速度，而在Alpha细胞生产期间减慢速度。

它在一个基于可能性的期望最大化框架中解决，通过迭代估计反应速率和潜在细胞特异性变量的参数，即转录状态和细胞内部潜伏时间。因此，它的目的是了解每个基因未拼接/已拼接阶段的轨迹。

在不需要任何实验数据的情况下，可以估计RNA转录、剪接和降解的速率。

它们有助于更好地理解细胞的特性和表型异质性。

The estimated gene-specific parameters comprise rates of transription (fit_alpha), splicing (fit_beta), degradation (fit_gamma), switching time point (fit_t_), a scaling parameter to adjust for under-represented unspliced reads (fit_scaling), standard deviation of unspliced and spliced reads (fit_std_u, fit_std_s), the gene likelihood (fit_likelihood), inferred steady-state levels (fit_steady_u, fit_steady_s) with their corresponding p-values (fit_pval_steady_u, fit_pval_steady_s), the overall model variance (fit_variance), and a scaling factor to align the gene-wise latent times to a universal, gene-shared latent time (fit_alignment_scaling).

动态模型恢复了潜在细胞过程的潜在时间。这一潜伏时间代表了细胞的内部时钟，仅根据其转录动力学，与细胞分化时所经历的实时时间近似。

驱动基因表现出明显的动态行为，并通过动态模型中的高可能性对其特征进行系统地检测。

此外，可以计算每个细胞集群的部分基因可能性，以实现集群特异性识别潜在驱动因素。

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机型：HTC Velocity 4G

销售地：香港

出厂日期：2012年02月16

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